漢族人群聚腺苷二磷酸核糖聚合酶
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【關(guān)鍵詞】 苷二磷酸核
【摘要】 目的：通過(guò)檢測(cè)人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（hPARP1）7個(gè)外顯子核苷酸多態(tài)性，了解在廣東的漢族人群中hPARP1基因多態(tài)性分布，為建立民族特色的DNA修復(fù)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)提供基礎(chǔ)資料。方法： 選取在廣東地區(qū)的漢族健康人群320名的基礎(chǔ)資料及血液樣本，抽提血液DNA，用PCR法擴(kuò)增hPARP1基因7個(gè)外顯子，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和銀染技術(shù)檢測(cè)hPARP1基因多態(tài)性，并進(jìn)行DNA序列測(cè)定。結(jié)果： 在廣東的漢族正常人320名血標(biāo)本的7個(gè)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP電泳條帶中，4個(gè)樣本hPARP1基因外顯子17的SSCP電泳條帶檢出1條多態(tài)性條帶，3個(gè)樣本第12 內(nèi)含子檢出1條多態(tài)性條帶，其余6個(gè)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP電泳未見(jiàn)多態(tài)性條帶。正常帶型DNA測(cè)序結(jié)果與genebank中已知序列完全一致，第17外顯子上有1種基因突變類型（T→C）。結(jié)論： 在廣東地區(qū)的漢族人群的hPARP1基因第17外顯子和第12 內(nèi)含子上可能存在多態(tài)性。
【關(guān)鍵詞】聚腺苷二磷酸核糖聚合酶－1；遺傳多態(tài)性；聚合酶鏈反應(yīng)
【Abstract】 Objective: To investigate the nucleotide polymorphisms and distributions of seven exons in human poly (ADPribose) polymerase1 (PARP1) gene and to contribute to the construction of the special DNA repair gene polymorphisms databank. Methods: The basic materials and blood samples from 320 Guangdong health Han population were collected. The polymorphism of exon 3,11,12,13,16,17 and exon 20 of hPARP1 gene were detected by PCRSSCP, and sequencing test were performed. Results: A polymorphisms of exon 20 of PARP1 gene was detected in 320 Han people by PCRSSCP, no abnormal bands were observed from the analysis of PCRSSCP in other exons. Also, DNA sequence of normal bands turned out that PCR products were target ones in Genebank, one type mutations (T→C) and (G→A)were detected in exon 17 and in intron 12. Conclusion: Polymorphisms may exist in exon 17 and intron 12 of hPARP1 gene in Guangdong Han population. PCRSSCP silver staining could be as a tool to screen rapidly the polymorphisms hPARP1 gene.
【Key words】 poly (ADPribose) polymerase1; genetic polymorphism; polymerase chain reaction
DNA修復(fù)系統(tǒng)在修復(fù)DNA損傷、維持基因組完整和穩(wěn)定性中起著不容忽視的作用。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly (ADPribose) polymerase1，PARP1］是真核細(xì)胞中存在的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶?？蓞⑴c許多與細(xì)胞功能有關(guān)的重要反應(yīng)，并與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療、預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)維持DNA的完整性方面起著重要的作用［1］，其多態(tài)位點(diǎn)的確認(rèn)對(duì)疾病易感性的流行病學(xué)研究具有重大意義?；驒z測(cè)能有效篩查基因突變攜帶者，可以為進(jìn)一步鑒定該突變功能上的意義提供基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)資料，因而具有重要的意義。本文應(yīng)用PCRSSCP基因篩查技術(shù)和分子流行病學(xué)方法檢測(cè)了在廣東的漢族人群中正常人hPARP1基因的多態(tài)性，為hPARP1基因多態(tài)性人群分布和建立民族特色的DNA修復(fù)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)提供基礎(chǔ)資料?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。
1 方法
1.1 樣本收集
選取在廣東地區(qū)的健康狀況良好(通過(guò)體檢選擇取)、無(wú)家族史和遺傳病史、三代及以上均為漢族的320名個(gè)體（其中男174例，女146例，年齡38～67歲，平均年齡（43.15±6.70）歲）并取血樣標(biāo)本。
1.2 血液DNA的抽提［2］
采集外周抗凝全血5 mL，用經(jīng)典酚氯仿法提取外周血DNA，并在4 ℃保存。
1.3 引物設(shè)計(jì)
根據(jù)已確定的hPARP1基因cDNA和內(nèi)含子/外顯子連接序列，用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)hPARP1基因7個(gè)外顯子的引物，該引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成 (表1) 。表1 擴(kuò)增hPARP1基因外顯子的引物序列
1.4 PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)總體積為25 μL，各成分終濃度為：引物0.125 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+1.8 mmol/L，DNA模板25～250 ng，Taq DNA聚合酶2.5u。反應(yīng)參數(shù)為：98 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，53～59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30次循環(huán)后72 ℃延伸8 min。以2％ 瓊脂凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。若與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)相比，擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，無(wú)雜帶，則可用于單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析。
1.5 SSCP分析
1.5.1 8％聚丙烯酰胺凝膠的配制 40％丙烯酰胺8 mL，10×Tris/硼酸電泳緩沖液 (TBE) 4 ml，10％過(guò)硫酸胺（AP）0.8 mL，N,N,N′,N′四甲基乙二胺(TEMED)53 μL，甘油4 mL，加水至40 mL。將聚丙烯酰胺凝膠混合物倒入玻璃板夾層，插入梳子，讓凝膠在室溫下聚合40～50 min，拔出梳子，沖洗樣孔。根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度，取0.2～2 μL產(chǎn)物加入20 μL甲酰胺變性液（98％去離子甲酰胺，0.05%溴酚藍(lán)和0.05%二甲苯青）中混勻，95 ℃熱變性5 min，立即置于冰上，點(diǎn)樣于預(yù)電泳30 min的上述8％聚丙烯酰胺凝膠中，在4～8 ℃環(huán)境中300V電泳6～10 h。
1.5.2 銀染步驟 參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行(1) 10％ 乙醇浸泡5 min；(2) 1％ HNO3浸泡5 min；(3) 0.2％ AgNO3 浸泡20 min；(4)顯影液(20 mL 1.4 mol/L 無(wú)水碳酸鈉＋50μL甲醛＋80 mL去離子水)，至條帶出現(xiàn)；(5) 10％ 醋酸浸泡5 min。以上每一步后均用去離子水洗2次，觀察結(jié)果并掃描成像保存。對(duì)陽(yáng)性結(jié)果樣本進(jìn)行2～3次PCRSSCP銀染重復(fù)試驗(yàn)。
1.6 DNA序列測(cè)定
對(duì)SSCP分析有異常泳動(dòng)帶的外顯子，擴(kuò)增DNA樣本，采用ABI377 全自動(dòng)基因分析儀對(duì)其進(jìn)行DNA序列測(cè)定并與GeneBank中所報(bào)道的序列進(jìn)行比較。
2 結(jié)果
2.1 DNA抽提結(jié)果
所抽提DNA樣本濃度及純度，均可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
2.2 PCR擴(kuò)增
320份DNA樣本的hPARP1基因7個(gè)外顯子均得到成功擴(kuò)增，各外顯子PCR反應(yīng)產(chǎn)物均為單一條帶，大小在175～362bp之間，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片斷大小一致 (圖1) 。
2.3 SSCP分析
經(jīng)PCRSSCP對(duì)7個(gè)外顯子進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測(cè)，320名漢族人中有4名的外顯子17和3名測(cè)序檢出內(nèi)含子12出現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，出現(xiàn)2種穩(wěn)定的帶型，顯示3條變性單鏈帶（異常泳動(dòng)條帶位置在2條正常單鏈的中間），其余6個(gè)外顯子均未發(fā)現(xiàn)異常帶型，顯示2條變性單鏈帶（圖2）。
2.4 測(cè)序
正常樣本7個(gè)外顯子雙向測(cè)序結(jié)果表明，所擴(kuò)增序列分別與Genbank中hPARP1基因7個(gè)外顯子的符合率達(dá)到100％。4例異常樣本第17外顯子和3例異常樣本第12外顯子測(cè)序結(jié)果，所擴(kuò)增序列有一處堿基發(fā)生突變，外顯子17在密碼子808處出現(xiàn)CAC→CGC，即組氨酸→精氨酸；第12外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)12內(nèi)含子在18731位出現(xiàn)G→A改變(圖3，圖4)。
1～8泳道分別為外顯子20、17、3、11、 DNA Mark DL2000及外顯子12、13、16。
圖1 PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳結(jié)果 第6泳道為異常標(biāo)本，其余泳道為正常標(biāo)本；“↓”：正常單鏈，“←”：異常單鏈。
圖2 hPARP1基因外顯子17 PCR產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳圖
第12 內(nèi)含子的18731位出現(xiàn)G→A的雜合性突變。
圖3 第12 內(nèi)含子正向測(cè)序圖 異常泳動(dòng)條帶樣本第17 外顯子反向測(cè)序結(jié)果：密碼子808出現(xiàn)T→C的雜合性突變。
圖4 第17 外顯子反向測(cè)序圖3 討論
PCRSSCP銀染技術(shù)是一種檢測(cè)基因突變非常敏感的方法。在大樣本量的分子流行病學(xué)研究中, 往往需要對(duì)多個(gè)基因或同一基因的多個(gè)外顯子進(jìn)行突變篩查, 這種工作不僅工作量大, 耗費(fèi)大, 操作繁瑣, 而且不易進(jìn)行質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SSCP多重PCR 法是一種快速檢測(cè)正常人群hPARP1 基因多態(tài)性的有用技術(shù)。它比用于檢測(cè)基因突變的其它方法［4］，如變性梯度凝膠電泳法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和直接測(cè)序更簡(jiǎn)單、更省財(cái)省力，適用于大樣本量人群的基因突變篩查和分子流行病學(xué)研究。
由于DNA 單鏈的構(gòu)像是未知的，SSCP的條件應(yīng)基于不同大小的DNA 片段，一般是靠經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定的，同時(shí)電泳溫度和凝膠濃度能明顯影響電泳的速度和單鏈DNA 分子的分辨率。SSCP不能確定堿基改變的準(zhǔn)確數(shù)量或改變的位點(diǎn)，突變位點(diǎn)的準(zhǔn)確定位必須依靠直接測(cè)序來(lái)完成。我們?cè)赟SCP 檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有異常泳動(dòng)條帶的樣本時(shí)，重新擴(kuò)增其DNA 進(jìn)行序列分析，結(jié)果均有基因突變。由此可見(jiàn)，SSCP 檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序結(jié)果的符合率高。在所有320份標(biāo)本中僅檢出4份樣本的第17 外顯子上的突變位點(diǎn)，其余6個(gè)外顯子均未檢出突變位點(diǎn)。與本室以前研究結(jié)果［3］相比，檢出率有提高。這是與本實(shí)驗(yàn)始終在同一電泳環(huán)境溫度(4℃)、凝膠濃度下對(duì)7個(gè)外顯子進(jìn)行電泳有關(guān)，還是與抽樣有關(guān)呢？其確切原因有待進(jìn)一步研究。
本研究用PCRSSCP法在320名廣東地區(qū)漢族人群中篩查出4名的hPARP1基因第17 外顯子有一種錯(cuò)義突變，檢出3例第12 內(nèi)含子有1種堿基突變發(fā)生。由于所檢測(cè)出的突變位點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道，因此無(wú)法與其他國(guó)家或民族的基因頻率進(jìn)行比較。同時(shí)，第17外顯子基因頻率大于1％，因而這一位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn)，可能成為一種有用的生物標(biāo)記，但要確證這一結(jié)論，有待增大樣本含量做進(jìn)一步研究。
目前除了本室對(duì)hPARP1基因多態(tài)性做了初步的探討外，還未見(jiàn)有其他學(xué)者報(bào)道。我們成功地利用PCRSSCP法篩檢了hPARP1基因7個(gè)外顯子在廣東地區(qū)漢族人群中多態(tài)性分布情況，為進(jìn)行大樣本量的人群篩查提供了一種有效的方法。因而，進(jìn)一步研究不同民族不同地區(qū)人群的hPARP1基因多態(tài)性分布的性質(zhì)和特點(diǎn)，對(duì)于研究不同民族的親緣關(guān)系以及民族起源問(wèn)題都有重要的科學(xué)價(jià)值［5］。
參考文獻(xiàn)：
［1］ REN Z F, ZHUANG Z X. Poly(ADPribose)polymerase, cell apoptosis and cancer［J］. Cancer Res Prev Treat,2000,27(3):236239.
［2］ 盧圣棟. 現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］. 2版. 北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999:108~109.
［3］ 唐煥文,莊志雄,梁海榮,等. 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1多態(tài)性的檢測(cè)［J］. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2003,19(10):11661168.
［4］ KURVINEN K, HIETANEN S, SYRJANEN K, et al. Rapid and effective detection of mutations in the p53 gene using nonradioactive singlestrand conformation polymorphism (SSCP) technique applied on Phast System［J］. J Virol Methods, 1995, 51(1): 43 53.
［5］ 唐煥文,莊志雄,梁海榮,等. 中國(guó)漢族、布依族和壯族群體中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1基因多態(tài)性［J］. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2003,24(5):432438.
【摘要】 目的：通過(guò)檢測(cè)人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（hPARP1）7個(gè)外顯子核苷酸多態(tài)性，了解在廣東的漢族人群中hPARP1基因多態(tài)性分布，為建立民族特色的DNA修復(fù)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)提供基礎(chǔ)資料。方法： 選取在廣東地區(qū)的漢族健康人群320名的基礎(chǔ)資料及血液樣本，抽提血液DNA，用PCR法擴(kuò)增hPARP1基因7個(gè)外顯子，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和銀染技術(shù)檢測(cè)hPARP1基因多態(tài)性，并進(jìn)行DNA序列測(cè)定。結(jié)果： 在廣東的漢族正常人320名血標(biāo)本的7個(gè)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP電泳條帶中，4個(gè)樣本hPARP1基因外顯子17的SSCP電泳條帶檢出1條多態(tài)性條帶，3個(gè)樣本第12 內(nèi)含子檢出1條多態(tài)性條帶，其余6個(gè)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP電泳未見(jiàn)多態(tài)性條帶。正常帶型DNA測(cè)序結(jié)果與genebank中已知序列完全一致，第17外顯子上有1種基因突變類型（T→C）。結(jié)論： 在廣東地區(qū)的漢族人群的hPARP1基因第17外顯子和第12 內(nèi)含子上可能存在多態(tài)性。
【關(guān)鍵詞】聚腺苷二磷酸核糖聚合酶－1；遺傳多態(tài)性；聚合酶鏈反應(yīng)
【Abstract】 Objective: To investigate the nucleotide polymorphisms and distributions of seven exons in human poly (ADPribose) polymerase1 (PARP1) gene and to contribute to the construction of the special DNA repair gene polymorphisms databank. Methods: The basic materials and blood samples from 320 Guangdong health Han population were collected. The polymorphism of exon 3,11,12,13,16,17 and exon 20 of hPARP1 gene were detected by PCRSSCP, and sequencing test were performed. Results: A polymorphisms of exon 20 of PARP1 gene was detected in 320 Han people by PCRSSCP, no abnormal bands were observed from the analysis of PCRSSCP in other exons. Also, DNA sequence of normal bands turned out that PCR products were target ones in Genebank, one type mutations (T→C) and (G→A)were detected in exon 17 and in intron 12. Conclusion: Polymorphisms may exist in exon 17 and intron 12 of hPARP1 gene in Guangdong Han population. PCRSSCP silver staining could be as a tool to screen rapidly the polymorphisms hPARP1 gene.
【Key words】 poly (ADPribose) polymerase1; genetic polymorphism; polymerase chain reaction
DNA修復(fù)系統(tǒng)在修復(fù)DNA損傷、維持基因組完整和穩(wěn)定性中起著不容忽視的作用。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly (ADPribose) polymerase1，PARP1］是真核細(xì)胞中存在的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶?？蓞⑴c許多與細(xì)胞功能有關(guān)的重要反應(yīng)，并與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療、預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)維持DNA的完整性方面起著重要的作用［1］，其多態(tài)位點(diǎn)的確認(rèn)對(duì)疾病易感性的流行病學(xué)研究具有重大意義?；驒z測(cè)能有效篩查基因突變攜帶者，可以為進(jìn)一步鑒定該突變功能上的意義提供基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)資料，因而具有重要的意義。本文應(yīng)用PCRSSCP基因篩查技術(shù)和分子流行病學(xué)方法檢測(cè)了在廣東的漢族人群中正常人hPARP1基因的多態(tài)性，為hPARP1基因多態(tài)性人群分布和建立民族特色的DNA修復(fù)基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)提供基礎(chǔ)資料?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。
1 方法
1.1 樣本收集
選取在廣東地區(qū)的健康狀況良好(通過(guò)體檢選擇取)、無(wú)家族史和遺傳病史、三代及以上均為漢族的320名個(gè)體（其中男174例，女146例，年齡38～67歲，平均年齡（43.15±6.70）歲）并取血樣標(biāo)本。
1.2 血液DNA的抽提［2］
采集外周抗凝全血5 mL，用經(jīng)典酚氯仿法提取外周血DNA，并在4 ℃保存。
1.3 引物設(shè)計(jì)
根據(jù)已確定的hPARP1基因cDNA和內(nèi)含子/外顯子連接序列，用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)hPARP1基因7個(gè)外顯子的引物，該引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成 (表1) 。表1 擴(kuò)增hPARP1基因外顯子的引物序列
1.4 PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)總體積為25 μL，各成分終濃度為：引物0.125 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+1.8 mmol/L，DNA模板25～250 ng，Taq DNA聚合酶2.5u。反應(yīng)參數(shù)為：98 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，53～59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30次循環(huán)后72 ℃延伸8 min。以2％ 瓊脂凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。若與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)相比，擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，無(wú)雜帶，則可用于單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析。
1.5 SSCP分析
1.5.1 8％聚丙烯酰胺凝膠的配制 40％丙烯酰胺8 mL，10×Tris/硼酸電泳緩沖液 (TBE) 4 ml，10％過(guò)硫酸胺（AP）0.8 mL，N,N,N′,N′四甲基乙二胺(TEMED)53 μL，甘油4 mL，加水至40 mL。將聚丙烯酰胺凝膠混合物倒入玻璃板夾層，插入梳子，讓凝膠在室溫下聚合40～50 min，拔出梳子，沖洗樣孔。根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度，取0.2～2 μL產(chǎn)物加入20 μL甲酰胺變性液（98％去離子甲酰胺，0.05%溴酚藍(lán)和0.05%二甲苯青）中混勻，95 ℃熱變性5 min，立即置于冰上，點(diǎn)樣于預(yù)電泳30 min的上述8％聚丙烯酰胺凝膠中，在4～8 ℃環(huán)境中300V電泳6～10 h。
1.5.2 銀染步驟 參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行(1) 10％ 乙醇浸泡5 min；(2) 1％ HNO3浸泡5 min；(3) 0.2％ AgNO3 浸泡20 min；(4)顯影液(20 mL 1.4 mol/L 無(wú)水碳酸鈉＋50μL甲醛＋80 mL去離子水)，至條帶出現(xiàn)；(5) 10％ 醋酸浸泡5 min。以上每一步后均用去離子水洗2次，觀察結(jié)果并掃描成像保存。對(duì)陽(yáng)性結(jié)果樣本進(jìn)行2～3次PCRSSCP銀染重復(fù)試驗(yàn)。
1.6 DNA序列測(cè)定
對(duì)SSCP分析有異常泳動(dòng)帶的外顯子，擴(kuò)增DNA樣本，采用ABI377 全自動(dòng)基因分析儀對(duì)其進(jìn)行DNA序列測(cè)定并與GeneBank中所報(bào)道的序列進(jìn)行比較。
2 結(jié)果
2.1 DNA抽提結(jié)果
所抽提DNA樣本濃度及純度，均可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
2.2 PCR擴(kuò)增
320份DNA樣本的hPARP1基因7個(gè)外顯子均得到成功擴(kuò)增，各外顯子PCR反應(yīng)產(chǎn)物均為單一條帶，大小在175～362bp之間，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片斷大小一致 (圖1) 。
2.3 SSCP分析
經(jīng)PCRSSCP對(duì)7個(gè)外顯子進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測(cè)，320名漢族人中有4名的外顯子17和3名測(cè)序檢出內(nèi)含子12出現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，出現(xiàn)2種穩(wěn)定的帶型，顯示3條變性單鏈帶（異常泳動(dòng)條帶位置在2條正常單鏈的中間），其余6個(gè)外顯子均未發(fā)現(xiàn)異常帶型，顯示2條變性單鏈帶（圖2）。
2.4 測(cè)序
正常樣本7個(gè)外顯子雙向測(cè)序結(jié)果表明，所擴(kuò)增序列分別與Genbank中hPARP1基因7個(gè)外顯子的符合率達(dá)到100％。4例異常樣本第17外顯子和3例異常樣本第12外顯子測(cè)序結(jié)果，所擴(kuò)增序列有一處堿基發(fā)生突變，外顯子17在密碼子808處出現(xiàn)CAC→CGC，即組氨酸→精氨酸；第12外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)12內(nèi)含子在18731位出現(xiàn)G→A改變(圖3，圖4)。
1～8泳道分別為外顯子20、17、3、11、 DNA Mark DL2000及外顯子12、13、16。
圖1 PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳結(jié)果 第6泳道為異常標(biāo)本，其余泳道為正常標(biāo)本；“↓”：正常單鏈，“←”：異常單鏈。
圖2 hPARP1基因外顯子17 PCR產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳圖
第12 內(nèi)含子的18731位出現(xiàn)G→A的雜合性突變。
圖3 第12 內(nèi)含子正向測(cè)序圖 異常泳動(dòng)條帶樣本第17 外顯子反向測(cè)序結(jié)果：密碼子808出現(xiàn)T→C的雜合性突變。
圖4 第17 外顯子反向測(cè)序圖3 討論
PCRSSCP銀染技術(shù)是一種檢測(cè)基因突變非常敏感的方法。在大樣本量的分子流行病學(xué)研究中, 往往需要對(duì)多個(gè)基因或同一基因的多個(gè)外顯子進(jìn)行突變篩查, 這種工作不僅工作量大, 耗費(fèi)大, 操作繁瑣, 而且不易進(jìn)行質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SSCP多重PCR 法是一種快速檢測(cè)正常人群hPARP1 基因多態(tài)性的有用技術(shù)。它比用于檢測(cè)基因突變的其它方法［4］，如變性梯度凝膠電泳法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和直接測(cè)序更簡(jiǎn)單、更省財(cái)省力，適用于大樣本量人群的基因突變篩查和分子流行病學(xué)研究。
由于DNA 單鏈的構(gòu)像是未知的，SSCP的條件應(yīng)基于不同大小的DNA 片段，一般是靠經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定的，同時(shí)電泳溫度和凝膠濃度能明顯影響電泳的速度和單鏈DNA 分子的分辨率。SSCP不能確定堿基改變的準(zhǔn)確數(shù)量或改變的位點(diǎn)，突變位點(diǎn)的準(zhǔn)確定位必須依靠直接測(cè)序來(lái)完成。我們?cè)赟SCP 檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有異常泳動(dòng)條帶的樣本時(shí)，重新擴(kuò)增其DNA 進(jìn)行序列分析，結(jié)果均有基因突變。由此可見(jiàn)，SSCP 檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序結(jié)果的符合率高。在所有320份標(biāo)本中僅檢出4份樣本的第17 外顯子上的突變位點(diǎn)，其余6個(gè)外顯子均未檢出突變位點(diǎn)。與本室以前研究結(jié)果［3］相比，檢出率有提高。這是與本實(shí)驗(yàn)始終在同一電泳環(huán)境溫度(4℃)、凝膠濃度下對(duì)7個(gè)外顯子進(jìn)行電泳有關(guān)，還是與抽樣有關(guān)呢？其確切原因有待進(jìn)一步研究。
本研究用PCRSSCP法在320名廣東地區(qū)漢族人群中篩查出4名的hPARP1基因第17 外顯子有一種錯(cuò)義突變，檢出3例第12 內(nèi)含子有1種堿基突變發(fā)生。由于所檢測(cè)出的突變位點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道，因此無(wú)法與其他國(guó)家或民族的基因頻率進(jìn)行比較。同時(shí)，第17外顯子基因頻率大于1％，因而這一位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn)，可能成為一種有用的生物標(biāo)記，但要確證這一結(jié)論，有待增大樣本含量做進(jìn)一步研究。
目前除了本室對(duì)hPARP1基因多態(tài)性做了初步的探討外，還未見(jiàn)有其他學(xué)者報(bào)道。我們成功地利用PCRSSCP法篩檢了hPARP1基因7個(gè)外顯子在廣東地區(qū)漢族人群中多態(tài)性分布情況，為進(jìn)行大樣本量的人群篩查提供了一種有效的方法。因而，進(jìn)一步研究不同民族不同地區(qū)人群的hPARP1基因多態(tài)性分布的性質(zhì)和特點(diǎn)，對(duì)于研究不同民族的親緣關(guān)系以及民族起源問(wèn)題都有重要的科學(xué)價(jià)值［5］。
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